禽白血病病毒ELISA抗原检测试剂盒

ALV-AG-96禽白血病病毒ELISA抗原检测
试剂盒使用说明书

【介绍】
本试剂盒用于禽白血病病毒 P27 抗原的检测。
本试剂盒是采用双抗体夹心酶联免疫吸附试验（DAS-ELISA）原理来检测禽白血病病毒的P27抗原。检测时，在相应的反应孔中加入阴、阳对照品和待测样品，经温育后，若样品中含有P27抗原，则与酶标板上的抗体结合形成抗原抗
体复合物，反之则不能结合。洗涤后，加入的酶标记物与包被板上的抗原抗体复合物发生特异性结合。再次洗涤后加入底物，酶催化底物反应呈现蓝色，颜色深浅与样品中P27抗原的含量成正相关，从而达到快速检测的目的。
【组份】
酶标板 1块（96孔/板） 底物液B 1瓶（6mL/瓶）
阴性对照（NC） 1管（2mL/管） 终止液 1瓶（12mL/瓶）
阳性对照（PC） 1管（2mL/管） 25×浓缩洗涤液 1瓶（30mL/瓶）
酶标记物工作液 1瓶（12mL/瓶） 说明书 1份
底物液A 1瓶（6mL/瓶） 盖板膜 1张
【需自备的设备及试剂】
酶标仪（650 nm）、去离子水、离心管、微量移液器、计时器、离心机（4000r/min）、棉签、氯化钠、氯化钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾等。
【样品制备】
取动物全血，按常规方法制备血清，要求血清清亮，无溶血。

【试剂配制】
a）0.01 mol/L pH=7.4 PBS 溶液：准确称取氯化钠 8.0 g、氯化钾 0.2 g、磷酸氢
二钠1.14 g和磷酸二氢钾0.24 g，加入去离子水溶解并定容至1 L。
b）洗涤工作液：使用前，浓缩的洗涤液应恢复至室温（20～25℃），并摇动，
使沉淀溶解（最好在37℃恒温培养箱中加热5～10 min），然后用蒸馏水作25 倍稀释（例如：30 mL 的浓缩洗涤液加上 720 mL 蒸馏水）混匀，稀释好的洗涤液2～8℃可存放7日。
【样品处理】
1. 蛋清：取全蛋，破碎后，直接取蛋清100μL。
2. 泄殖腔拭子：取棉签于待检鸡只泄殖腔取样，然后放入1 mL PBS溶液（0.01mol/L，pH 值 7.4）中，-20℃以下冰箱中冻融一次，待其恢复至室温后，取 100 μL 进行检测。
3. 疫苗：疫苗稀释液将疫苗溶解，再用0.01 mol/L pH=7.4 PBS稀释10-20倍后，取100μL进行检测。
4. 胎粪：无需稀释，可以直接用于检测，若样品中含有沉淀或杂质，需在2000~3000 r/min，离心 10 min，取 100 μL 上清进行检测。
【注意事项】
1. 本品仅供体外检测使用。
2. 不同批号试剂盒中的组份不可混用。
3. 勿使用过期的试剂盒，已开封的组份应在有效期内使用。
4. 必须使用符合药典规定的水（如蒸馏水、去离子水或纯水）稀释洗涤液。
5. 试剂盒各组份在使用前应预先平衡至室温（25±2℃）。
6. 未使用的酶标板应放回铝箔袋并封口，2～8℃保存。
7. 应避免使用金属类物质盛装和搅拌试剂。
8. 勿将底物溶液暴露于强光下。
9. 本品终止液为强酸，避免同眼、皮肤接触。
10. 移液系统应保证准确清洁，应提供准确溶液体积的同时不造成交叉污染。
【操作步骤】
1. 取酶标板（根据样品多少，可拆开分次使用），阴性对照、阳性对照和待检样品各取100 µL加至相应微孔中，盖好盖板膜，轻轻振荡酶标板10 s，充分混匀，室温下（25±2℃）避光反应60 min。
注：阴、阳性对照各设2孔，待检样品设1孔。
2. 甩掉孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液300μL，震荡洗涤4次，每次30s 左右，在干净吸水纸上拍打去除残存洗涤液。
3. 每孔加入100μL酶标记物工作液，盖好盖板膜，室温下（25±2℃）避光反应60 min。
4. 弃去孔中的溶液，洗涤4次，方法同2。
5. 底物A液与底物B液按1:1混合均匀，加入孔中，100 µL/孔，盖上盖板膜，室温下（25±2℃）反应15 min。
注：底物工作液也可提前配制，但配制完后需5 min内使用。每孔加入终止液100μL，5 min内测定结果。
注：若终止液出现絮状结晶，可37℃加热，待其溶解后使用。
【结果判定】
1. 在酶标仪上读各孔OD650nm值，计算出阴性对照孔OD均值NC和阳性对照孔OD均值PC。
注：NC值＜0.200且0.500＜PC值≤2.000，试验结果才有效。否则，应进行重复试验。
2. 按照公式计算出S/P值：S/P=（SC-NC）/（PC-NC）。
注：SC为被检样品孔OD值。
3. 如果S/P＜0.17，说明样品中无禽白血病病毒P27蛋白；如果S/P≥0.17，说明样品中有禽白血病病毒P27蛋白。
【有效期】
2~8℃避光保存，有效期为 12 个月。