Apllap Tsc DNA连接酶(来自高温活性栖热菌)

货号:E9015-85-4-500U

规格:500U

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商品描述

 Tsc DNA连接酶(来自高温活性栖热菌)

具有热稳定性的NAD +依赖性双链DNA连接酶,在15至75°C的温度下具有活性。
描述
来自高温活性栖热菌的DNA连接酶是一种热稳定的NAD +依赖性双链DNA连接酶,在15至75°C的温度下具有活性。该酶对平端DNA片段没有活性。
产品提供500单位,以及10x反应缓冲液。
                                                                                                                                                                                                                      产品描述
介绍:
Tsc DNA连接酶催化双链DNA结构中相邻3′-羟基和5′-磷酸末端的NAD依赖性连接。与T4 DNA连接酶相反,Tsc DNA连接酶对平末端DNA片段没有可检测的活性。与T4 DNA连接酶不同,Tsc DNA连接酶在4 bp和2 bp的内聚末端在最佳温度条件下仅表现出最小的连接活性。Tsc DNA连接酶对RNA靶没有活性。Tsc DNA连接酶是从大肠杆菌菌株中分离和纯化的,该菌株带有一个质粒,该质粒具有克隆的DNA连接酶基因,该基因来自冰岛分离的嗜热细菌水管致黑栖热菌(1,2)。 连接酶的半衰期在91°C下为26分钟(3)。该酶的反应温度范围很广,下限约为15℃,上限由DNA底物的解链温度(Tm)决定。该酶在pH范围为7-9的各种DNA聚合酶缓冲液中也有活性。在最佳条件下,与其他常见的热稳定连接酶相比,Tsc DNA连接酶的寡核苷酸连接速率和程度要高得多(4,5)。
 
应用范围:
Tsc DNA连接酶是需要高温,高严格双链DNA连接的应用的理想酶.Tsc DNA连接酶可
用于:
用于扩增DNA靶标的连接酶链反应(LCR)(6-8)。
用于突变分析的寡核苷酸连接测定法(OLA)(9-10)。
重复扩增检测(11)仅用于研究遗传异常,例如三核苷酸重复,而不用于诊断目的(例如易碎X,亨廷顿病)。
来自重叠寡核苷酸的基因合成(12)。                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               存储:
储存和稀释缓冲液:20 mM Tris-HCl,50 mM KCl,0.1 mM EDTA,0.1%Triton X-100(v / v),1 mM二硫苏糖醇(DTT),50%甘油(v / v) ,pH 7.6(25°C)。 Tsc连接酶在–15°C至-25°C下保存时稳定。
                                                                                                                                                                                                              反应条件:
1 x反应缓冲液(已提供10 x)20 mM Tris-HCl,20 mM KCl,10 mM MgCl2、0.1%Nonidet P40(v / v),0.5 mM NAD,1 mM DTT,pH 7.5( 25°C)。
浓度和单位定义
浓度10 U /μl。一单位Tsc DNA连接酶可在45°C下于1分钟内催化1μgBstEII消化的λDNA的cos位点的50%连接。
                                                                                                                                                                                                                                       应用协议:
寡核苷酸连接的反应方案:
解冻下面列出的组件,然后将其放在冰上。在设置反应之前,先短暂涡旋并离心所有试剂。在置于冰上的微量离心管中设置反应成分:
成分                     容量                 最终浓度
反应缓冲液(10x)         2.0μl               1 x
寡核苷酸1                 Xμl                1-30nM
寡核苷酸2                 Xμl                1-30nM
模板DNA                   Xμl                0.1ng
Tsc DNA连接酶             0.5μl              5U
加入无菌水                高达20.0μl 
总量                      20.0μl 
典型的温度曲线为:94°C 2分钟,94°C 30秒,45-65°C 3分钟,并重复最后两个温度进行30个循环。 99°C 10分钟。                                                                                                                                                                                                                                                                                             活性测定:
用于单位定义的酶测定法是用BstII消化的λDNA的cos位点的连接。
成分                     容量                   最终浓度
反应缓冲液(10x)         2.0μl                 1x
λDNA(已消化BstEII)     Xμl                   1μg
Tsc DNA连接酶            稀释系列 
加入无菌水               高达20.0μl 
总量                     20.0μl 
在45°C孵育1-15分钟。在干冰/乙醇浴中停止反应。在琼脂糖凝胶上分析之前,在65°C下孵育10分钟(融解未连接的cos位点)
通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色测定结果。
                                                                                                                                                                                                              质量控制:
如下所述,分析每批活性 ssDNA连接酶的活性和污染活性。
                                                                                                                                                                                                               缺少DNA核酸内切酶:
在25μl反应中,将0.25μg超螺旋pBR322 DNA与递增量的Tsc DNA连接酶在37°C下孵育16小时。大于100 U的Tsc DNA连接酶显示pBR322 DNA的超螺旋结构没有松弛。
在37℃和64℃下,在25 µl反应中用Tsc DNA连接酶诱导加入0.25 µgλ-DNAEco RI / HindIII片段16 h。 100 U的Tsc DNA连接酶显示未改变条带模式。
                                                                                                                                                                                                              缺少核酸外切酶:
将越来越多的Tsc DNA连接酶在50μl含有[3H]标记的DNA的测试缓冲液中于37°C和64°C孵育4小时。显示无核酸外切酶活性的酶量> 100U。
缺少核糖核酸酶:
根据制造商规程,使用了Ambion的RNaseAlertTM实验室测试套件检测RNase活性。 1小时后,在37°C孵育X U Tsc DNA连接酶后,未检测到RNase活性。
 
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